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張友明等發(fā)現(xiàn)直接克隆大片斷DNA方法 |
| 發(fā)布時間：2012-05-12 文章來源：本站 瀏覽次數(shù)：4166 |
鎖定鋼板近日，留學德國的中國學者符軍和卞小瑩在張友明博士的主要指導下發(fā)現(xiàn)了基于重組工程的直接克隆大片斷DNA的方法。相關論文發(fā)表于4月29日在國際聞名期刊《天然—生物技術》（Nature Biotechnology）上發(fā)表。
微生物能夠產生大量具有生物活性的次生代謝產物，好比抗生素（紅霉素），抗癌藥物（埃博霉素）以及殺蟲劑（阿維菌素）等等。近年來盛行的細菌基因組測序工程表明，細菌染色體上存在著大量未鑒定的自然產物生物合成基因簇，又稱為“孤兒基因簇”。
微生物次生代謝產物大多數(shù)是由聚酮合成酶（PKS）和非核糖體多肽合酶（NRPS）等大型復合酶合成的。但是因為一些細菌不能在實驗室前提下生長，或者這些“孤兒基因簇”在實驗室前提下是沉默沉靜的。因此，將這些生物合成基因簇克隆到大腸桿菌的載體上，通過潤飾或者替代啟動子，然后在一些生長快，易培養(yǎng)和遺傳操縱簡樸的異源宿主中表達，是一種發(fā)現(xiàn)這些沉默沉靜自然產物的有效方法。而且，這些基因簇還可以通過基因刪除，插入和交換，產生更多的“非自然”的自然化合物，也就是所謂的自然產物的“組合生物合成”。
但是這些自然產物的生物合成基因簇一般都大于10kb， 有的甚至大于100kb�，F(xiàn)行的克隆DNA片斷的方法不能知足高通量的功能基因組學研究的需要。好比PCR技術和全新的DNA合成只能得到小于5kb的DNA片斷。黏�；蛘呒毦斯と旧w（BAC）基因文庫的構建和篩選是克隆大型自然產物 生物合成基因簇的經(jīng)典方法。但是這些方法還需要后續(xù)的費時費力的篩選以及復雜的基因簇 縫合工作。
傳統(tǒng)的重組工程方法一般使用大腸桿菌中的λ 噬菌體Red 操作子中的Redα, Redβ and Redγ來實現(xiàn)大腸桿菌中的線性DNA片斷和環(huán)狀DNA之間的同源重組。大腸桿菌中的Rac 前噬菌體也包含一對跟Red功能相似的蛋白RecE和RecT 也能用于重組工程。但是先前的研究發(fā)現(xiàn)RecE一般只用碳末真?zhèn)�588個氨基酸就足夠完成有效地同源重組，盡管不如Red體系效率高。所以Red體系在廣泛地應用在基因敲除、插入和潤飾等。RecE蛋白包含866個氨基酸殘基，遠遠多于跟它功能相同的蛋白Redα（226個氨基酸殘基）。因此研究職員發(fā)現(xiàn)全長的RecE蛋白和RecT蛋白能高效的催化兩個線性DNA分子的同源重組（linear plus linear homologous recombination， LLHR）。
進而，研究職員利用新發(fā)現(xiàn)的線性DNA分子的同源重組能夠正確的從BAC或者酶切的染色體混合物中直接克隆選擇的DNA片斷。研究職員應用該技術從純化的發(fā)光桿菌的染色體上直接克隆了十個未知的自然產物的生物合成基因簇（PKS/NRPS，10-52kb），并將它們在大腸桿菌中表達，鑒定了其中兩個基因簇的終極產物。全長的RecE蛋白和RecT蛋白介導的直接克隆方法極大的豐碩了DNA重組工程技術，也將加速微生物自然產物的生物探礦研究，同時，此項技術還可以應用于人類個體醫(yī)療中的基因診斷和研究。由德國德累斯頓產業(yè)大學，德國亥姆霍茲感染研究中央，中國湖南師范大學和德國基因橋公司合作完成。 骨科鋼板生產廠家 |
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