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分子剪刀改造微藻基因組 助推第三代生物燃料研發(fā) |
| 發(fā)布時(shí)間：2012-09-04 文章來源： 瀏覽次數(shù)：5610 |
鎖定鋼板近日，法國(guó)大型生物技術(shù)公司Cellectis總裁安德烈·舒利卡先生(Andre Choulika)表示，從現(xiàn)在起到2013年1月公司將證實(shí)基因組改造能使用微藻來制造第三代生物燃料。目前Cellectis公司應(yīng)主要證實(shí)其技術(shù)在藻類植物中的有效性。
Cellectis公司研發(fā)了能夠干涉干與脫氧核糖核酸(ADN)的分子剪刀，通過此分子剪刀，公司能夠改變或更換疾病突變載體基因，并改變植物機(jī)體。該公司還負(fù)責(zé)實(shí)現(xiàn)分子剪刀的貿(mào)易化。公司已經(jīng)將該技術(shù)推廣到生物出產(chǎn)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)的學(xué)術(shù)研究中。
基因組改造實(shí)驗(yàn)假如成功，從2013年1月起的未來四年內(nèi)公司將在法國(guó)石油化工團(tuán)體道達(dá)爾公司(Total)的協(xié)助下進(jìn)行石油代用品的試驗(yàn)出產(chǎn)。該階段的投資金額將達(dá)到數(shù)百萬歐元。
根據(jù)雙方簽訂的協(xié)議，Cellectis公司和道達(dá)爾公司將共同支付該項(xiàng)目所需的本錢。目前，兩家公司均沒有透漏相關(guān)的財(cái)務(wù)信息。從2012年2月起十名研究職員就已經(jīng)開始共同從事該項(xiàng)目的研究，此外，兩家公司將分別持有相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品50%的份額。舒利卡先生表示，在最初幾年內(nèi)，該項(xiàng)目每年的開發(fā)本錢將至少為數(shù)百萬歐元。而在試點(diǎn)階段，所需金額將達(dá)到數(shù)千萬歐元。
基因組改造技術(shù)
普魯蘭酶基因克隆表達(dá)及枯草芽孢桿菌基因組的改造[1]
根據(jù)整合到基因組上的目的基因來源，分別構(gòu)建了兩種整合方式的載體，即單交換和雙交換整合載體。對(duì)于枯草芽孢桿菌本身來源的巰基-二硫鍵氧化還原酶基因bdbC，bdbD，直接將其作為同源片段，因?yàn)?FONT face="Times New Roman">bdbC，bdbD共用一個(gè)啟動(dòng)子，在基因組上以操作子的形式存在，因此構(gòu)建的單交換載體命名為pACC-BdbDC。對(duì)于大腸桿菌來源的巰基-二硫鍵氧化還原酶基因ds.C，dsbD，dsbE，dsbG，則需要在枯草芽孢桿菌基因組上選擇整合位點(diǎn)，在其整合位點(diǎn)四周各選取500bp基因作為同源片段，克隆到pBSK-p1p4-Cm上，構(gòu)建了基因敲除載體。再將dsbC，dsbD，dsbE，dsbG插入到該載體的兩個(gè)同源片段之間，分別構(gòu)建了雙交換載體pDGC和pDsbE。將以上構(gòu)建好的單交換和雙交換載體分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌B.su.168，結(jié)果巰基-二硫鍵氧化還原酶基因整合到枯草芽孢桿菌基因組上，成功改造了枯草芽孢桿菌遺傳背景。
戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建及其改造[2]
傳統(tǒng)的以限制性內(nèi)切酶和連接酶為基礎(chǔ)的DNA重組技術(shù)曾經(jīng)革命性地推動(dòng)了分子生物學(xué)和遺傳工程的發(fā)展，至今仍舊施展著重要作用。但是實(shí)驗(yàn)室原有的片斷太多，找酶切位點(diǎn)比較難題。用overlap pcr連成4個(gè)長(zhǎng)片斷后就相對(duì)輕易一些，利用4626位置上的KpnⅠ和載體上的XbaⅠ這兩個(gè)酶切位點(diǎn)將中間兩段連接，從而形成3個(gè)大片斷（1～2474，2094～6645，5186～7232）。In-fusion法的原理跟基因同源重組類似，利用DNA片斷的同源關(guān)系將目的片斷定向地插入載體中。這個(gè)方法只需一個(gè)單一的酶切位點(diǎn)將載體線性化即可，不需要兩個(gè)單一的酶切位點(diǎn)，前提沒有前面苛刻，所以結(jié)合這個(gè)方法用于最后兩步連接。先利用載體上的XbaⅠ酶切位點(diǎn)將前兩段連接（1～5318），然后利用5245位置上的FseⅠ酶切位點(diǎn)將最后兩段連成HEV的全長(zhǎng)cDNA。In-fusion法需要重新設(shè)計(jì)引物，使目的基因的兩端帶有載體兩真?zhèn)�同源序列。固然也涉及到PCR過程，但是以質(zhì)粒為模板，難度相對(duì)overlap PCR要小，可以擴(kuò)增3kb左右大小的片斷用于連接。
為了保證這個(gè)HEV的全長(zhǎng)cDNA克隆具有感染性，又對(duì)它進(jìn)行了修正。在測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)5’端有94個(gè)堿基與原序列比對(duì)不上，另外在2467的位置多出了5個(gè)堿基，我們需要將這一段替代掉。為了保證序列的正確性，重新從病料中提取SAAS-JDY5株的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）。設(shè)計(jì)套式特異性引物，并在5’端引入T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，進(jìn)行巢式PCR（Nest-PCR）擴(kuò)增出目的片斷，用新的準(zhǔn)確的片斷替代掉原來錯(cuò)誤的片斷，獲得準(zhǔn)確的SAAS-JDY5株HEV的全長(zhǎng)cDNA克隆。
基于基因組DNA誘變的遺傳重組改造乙醇產(chǎn)業(yè)酵母的耐熱性及發(fā)酵機(jī)能[3]
通過化學(xué)誘變和基于基因組DNA誘變的遺傳重組技術(shù)對(duì)乙醇產(chǎn)業(yè)酵母菌的溫度適應(yīng)性進(jìn)行改造，獲得耐熱機(jī)能和發(fā)酵機(jī)能得到進(jìn)步的重組釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae T44-2。重組菌株T44-2的最高生長(zhǎng)溫度比原始菌株CE6進(jìn)步了3℃，48℃和52℃熱激處理1 h，重組菌株的細(xì)胞存活率分別是原始菌株的1.84和1.87倍。重組菌株在30℃～40℃范圍內(nèi)具有良好的糖醇轉(zhuǎn)化率和乙醇產(chǎn)量，發(fā)酵200g/L葡萄 糖能夠產(chǎn)生83.8～91.2 g/L乙醇。重組菌株在43℃和44℃發(fā)酵時(shí)乙醇產(chǎn)量仍分別有69.2 g/L和52.6g/L，而此時(shí)原始菌株基本沒有活性。研究結(jié)果為釀酒酵母在乙醇高溫發(fā)酵中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，可極大降低冷卻本錢。
生物燃料研究
生物燃料最新發(fā)展態(tài)勢(shì)分析[4]
第一代生物燃料的出產(chǎn)工藝已經(jīng)較為成熟，美國(guó)、歐盟和巴西等一些國(guó)家已經(jīng)形成了較完善的工業(yè)鏈。以纖維素乙醇為代表的第二代生物燃料是更有但愿的替換燃料，但目前還未獲得樞紐性的技術(shù)突破，其大規(guī)模的貿(mào)易化出產(chǎn)尚待時(shí)日。目前生物燃料正處于從第一代向第二代發(fā)展過渡的初期。各國(guó)紛紛將發(fā)展第二代生物燃料定為國(guó)策，為此制訂了長(zhǎng)期的發(fā)展規(guī)劃與目標(biāo)，并為生物燃料發(fā)展提供了良好的政策環(huán)境和鼎力的經(jīng)費(fèi)支持。各相關(guān)研究機(jī)構(gòu)與企業(yè)也積極步履，力圖解決生物燃料發(fā)展的各個(gè)樞紐題目。在此過程中，一些與生物燃料可持續(xù)發(fā)展有關(guān)的重要題目也引起了人們的關(guān)注。
利用藻類生物質(zhì)制備生物燃料研究進(jìn)展[5]
生物柴油和生物質(zhì)油的可持續(xù)健康不亂發(fā)展，必需有不亂和優(yōu)質(zhì)的原料來源。藻類生物質(zhì)等于出產(chǎn)生物燃料的優(yōu)良原料。本論文先容了微藻的概念，綜述了利用微藻制備生物柴油和生物質(zhì)油的海內(nèi)外研究進(jìn)展，尤其是制備微藻方面的生物基因工程、新反應(yīng)器和聯(lián)產(chǎn)技術(shù)，以及微藻直接熱解制備生物質(zhì)油和直接燃燒利用的技術(shù)。探討了利用微藻制備生物燃料的長(zhǎng)處和存在的題目。
Cellectis公司的舉動(dòng)
法國(guó)Cellectis公司獲得日本Tobacco公司Pureintro技術(shù)授權(quán)
法國(guó)基因技術(shù)公司Cellectis公司的美國(guó)分公司Cellectis Plant Sciences（位于明尼蘇達(dá)州圣保羅）獲得了日本Tobacco公司授權(quán)，獲準(zhǔn)使用Tobacco公司的泥土桿菌介質(zhì)轉(zhuǎn)化植入技術(shù) PureIntro，celletics公司將可以使用這個(gè)技術(shù)來研發(fā)轉(zhuǎn)基因玉米和水稻產(chǎn)品。
Cellctis 公司在大范圍核酸酶基因工程研究領(lǐng)域處于領(lǐng)先地位，它的很多研究成果被成功運(yùn)用于多種作物上，能對(duì)基因序列進(jìn)行插入，刪除或者改性操縱，使得植物能表達(dá)出 新的性狀（好比抗旱，進(jìn)步營(yíng)養(yǎng)成分，抗病害等），美國(guó)分公司Cellectis plant sciences是于今年剛剛成立的，負(fù)責(zé)基因工程涉農(nóng)領(lǐng)域的全面研究。
Cellectis推出源于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）的肝細(xì)胞產(chǎn)品
法國(guó)生物公司Cellectis團(tuán)體下的Cellectis干細(xì)胞部公布推出來源于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）的肝細(xì)胞產(chǎn)品，即hiPS-HEP。hiPS-HEP具同質(zhì)性、再生性及生命周期長(zhǎng)且CYP活性不亂的特點(diǎn)，能夠?yàn)樗幬锇l(fā)現(xiàn)、毒性試驗(yàn)與疫苗研發(fā)等一系列體外研究提供理想的平臺(tái)。
Cellectis干細(xì)胞部首席科學(xué)家（CSO）Johan Hyllner表示，各醫(yī)藥工業(yè)間的的高度相關(guān)性會(huì)使hiPS-HEP成為頗具遠(yuǎn)景的研發(fā)系統(tǒng)�！爸扑幤髽I(yè)迫切需要應(yīng)用于藥物研制早期更佳的、與臨床相關(guān)性更高的模型，以評(píng)價(jià)肝毒性、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)及研發(fā)新疫苗，”Hyllner 增補(bǔ)道。hiPS-HEP來源于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS），嚴(yán)格依照質(zhì)量控制和倫理批準(zhǔn)程序。
[1] 胡海紅.普魯蘭酶基因克隆表達(dá)及枯草芽孢桿菌基因組的改造. 生物化學(xué)與分子生物學(xué). 2009
[2] 王茜.戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建及其改造. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué). 2010
[3] 劉秀穎，何秀萍，盧瑩，張博潤(rùn).基于基因組DNA誘變的遺傳重組改造乙醇產(chǎn)業(yè)酵母的耐熱性及發(fā)酵機(jī)能. 生物工程學(xué)報(bào). 2011
[4] 鄧勇,房俊民,陳方,陳云偉,王春明.生物燃料最新發(fā)展態(tài)勢(shì)分析[J]. 中國(guó)生物工程雜志. 2008
[5] 嵇磊, 張利雄, 姚志龍, 閔恩惠膏澤.利用藻類生物質(zhì)制備生物燃料研究進(jìn)展[J].石油學(xué)報(bào).2007 （生物谷Bioon.com） 骨科鋼板生產(chǎn)廠家 |
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