張友明等發(fā)現(xiàn)直接克隆大片斷DNA方法

發(fā)布時間：2012-05-12 文章來源：本站瀏覽次數(shù)：4168

鎖定鋼板近日，留學(xué)德國的中國學(xué)者符軍和卞小瑩在張友明博士的主要指導(dǎo)下發(fā)現(xiàn)了基于重組工程的直接克隆大片斷DNA的方法。相關(guān)論文發(fā)表于4月29日在國際聞名期刊《天然—生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）上發(fā)表。

微生物能夠產(chǎn)生大量具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，好比抗生素（紅霉素），抗癌藥物（埃博霉素）以及殺蟲劑（阿維菌素）等等。近年來盛行的細(xì)菌基因組測序工程表明，細(xì)菌染色體上存在著大量未鑒定的自然產(chǎn)物生物合成基因簇，又稱為“孤兒基因簇”。

微生物次生代謝產(chǎn)物大多數(shù)是由聚酮合成酶（PKS）和非核糖體多肽合酶（NRPS）等大型復(fù)合酶合成的。但是因為一些細(xì)菌不能在實驗室前提下生長，或者這些“孤兒基因簇”在實驗室前提下是沉默沉靜的。因此，將這些生物合成基因簇克隆到大腸桿菌的載體上，通過潤飾或者替代啟動子，然后在一些生長快，易培養(yǎng)和遺傳操縱簡樸的異源宿主中表達(dá)，是一種發(fā)現(xiàn)這些沉默沉靜自然產(chǎn)物的有效方法。而且，這些基因簇還可以通過基因刪除，插入和交換，產(chǎn)生更多的“非自然”的自然化合物，也就是所謂的自然產(chǎn)物的“組合生物合成”。

但是這些自然產(chǎn)物的生物合成基因簇一般都大于10kb，有的甚至大于100kb�，F(xiàn)行的克隆DNA片斷的方法不能知足高通量的功能基因組學(xué)研究的需要。好比PCR技術(shù)和全新的DNA合成只能得到小于5kb的DNA片斷。黏�；蛘呒�(xì)菌人工染色體（BAC）基因文庫的構(gòu)建和篩選是克隆大型自然產(chǎn)物生物合成基因簇的經(jīng)典方法。但是這些方法還需要后續(xù)的費時費力的篩選以及復(fù)雜的基因簇縫合工作。

傳統(tǒng)的重組工程方法一般使用大腸桿菌中的λ 噬菌體Red 操作子中的Redα, Redβ and Redγ來實現(xiàn)大腸桿菌中的線性DNA片斷和環(huán)狀DNA之間的同源重組。大腸桿菌中的Rac 前噬菌體也包含一對跟Red功能相似的蛋白RecE和RecT 也能用于重組工程。但是先前的研究發(fā)現(xiàn)RecE一般只用碳末真?zhèn)€588個氨基酸就足夠完成有效地同源重組，盡管不如Red體系效率高。所以Red體系在廣泛地應(yīng)用在基因敲除、插入和潤飾等。RecE蛋白包含866個氨基酸殘基，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于跟它功能相同的蛋白Redα（226個氨基酸殘基）。因此研究職員發(fā)現(xiàn)全長的RecE蛋白和RecT蛋白能高效的催化兩個線性DNA分子的同源重組（linear plus linear homologous recombination， LLHR）。

進(jìn)而，研究職員利用新發(fā)現(xiàn)的線性DNA分子的同源重組能夠正確的從BAC或者酶切的染色體混合物中直接克隆選擇的DNA片斷。研究職員應(yīng)用該技術(shù)從純化的發(fā)光桿菌的染色體上直接克隆了十個未知的自然產(chǎn)物的生物合成基因簇（PKS/NRPS，10-52kb），并將它們在大腸桿菌中表達(dá)，鑒定了其中兩個基因簇的終極產(chǎn)物。全長的RecE蛋白和RecT蛋白介導(dǎo)的直接克隆方法極大的豐碩了DNA重組工程技術(shù)，也將加速微生物自然產(chǎn)物的生物探礦研究，同時，此項技術(shù)還可以應(yīng)用于人類個體醫(yī)療中的基因診斷和研究。由德國德累斯頓產(chǎn)業(yè)大學(xué)，德國亥姆霍茲感染研究中央，中國湖南師范大學(xué)和德國基因橋公司合作完成。骨科鋼板生產(chǎn)廠家

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